Doktorsvörn lyfjavísindum - Vivien Nagy

Þriðjudaginn 17. desember 2024 ver Vivien Nagy doktorsritgerð sína í lyfjavísindum við Lyfjafræðideild Háskóla Íslands. Ritgerðin ber heitið: Hámörkun efnasmíða N-asýl og N-alkýl-kítósans og rannsóknir á notkun þeirra. Design of Experiments Optimization of N-acyl and N-alkyl Chitosan Synthesis and Application Investigations.  Andmælendur eru dr. Luminita Marin, rannsóknastjóri Petru Poni Institute of Macromolecular Chemistry, Rúmeníu, og dr. Ögmundur Viðar Rúnarsson, verkefnastjóri hjá þróunardeild Alvotech. Umsjónarkennari og leiðbeinandi var Már Másson, prófessor við Lyfjafræðideild. Auk hans sátu í doktorsnefnd Bergþóra Sigríður Snorradóttir, lektor,  Christiaan Petrus Richter, prófessor, Elvar Örn Viktorsson, lektor og Héléne Liette Lauzon,  forstöðumaður rannsóknar og þróunar hjá Primex. Berglind Eva Benediktsdóttir, deildarforseti Lyfjafræðideildar, stjórnar athöfninni sem fer fram í Hátíðasal Háskóla Íslands og hefst kl. 13.00.

Ágrip

 Kítósan er náttúruleg fjölliða með víðtækt notagildi. Hún er örveruhemjandi, óeitruð og hefur lífsamrýmanleika auk þess að vera niðurbrjótanleg. Þessir eiginleikar gera fjölliðuna áhugaverða til notkunar í lyfja- og læknisfræðilegum tilgangi. Rannsóknir á kítósani snúa að þróun afleiða með betri leysni, sem og aðra betrumbætta eiginleika. Doktorsverkefnið fjallar um að þróa skilvirkar, hagkvæmar og uppskalanlegar aðferðir til að framleiða N-alkýl og N-asýl kítósan afleiður, með svokölluðum "Design of Experiments" (DoE) tilraunahönnunaraðferðum, og hámarka setni (e. degree of substitution; DS) fjölliðunnar ásamt því að betrumbæta líffræðilega eiginleika hennar með tilliti til notkunar í lyfja- og læknisfræði.                                                                      Fyrir efnasmíðar á N,N,N-trímetýlkítósan (TMC) voru framkvæmdar alls átta DOE tilraunir, ýmist runubundnar, þrepaskiptar eða fullþáttaðar hannanir. Lykilbreytur eins og alkýlerandi efni, basar, mólhlutföll, leysar, hitastig, aðferðir við bætingu basa, sem og hvarftímar voru hámarkaðar. Efnasmíð í einu skrefi fyrir TMC var þróuð með hárri setni af trímetýlhópum (e. Degree of trimethylation; DTM) án O-metýleringar. Til að bregðast við seigju vanda í hvörfum var notaður nýr basi, N,N-díísóprópýletýlamín (DIPEA), með þrepaskiptri viðbætingu. Þessi nýja aðferð áætluð fyrir notkun á stærri iðnaðarskala gaf háar heimtur á DTM án O-metýleringar. Fjöljónanlegar fléttu-nanóagnir(NPs) voru myndaðar á grunni TCM og kondríótín súlfats. In vitro prófanir á lífsamrýmanleika og frumudrepandi eituráhrifum voru framkvæmdar á mennskum þekjufrumum og krabbameinsfrumulínum með uppruna úr legi. Rannsökuð voru áhrif DTM, mólþyngdar og myndun NPs. 

DoE greining fyrir röð áður framkvæmdra tilrauna á efnasmíðaferlum fyrir samtengdar kítósan-hýdroxýsinnamínsýru fjölliður var gerð. Borin voru kennsl á lykilþætti ferlanna og líffræðilegir eiginleikar samtengdra fjölliða, þar á meðal andoxunar- og örveruhemjandi áhrif, voru rannsakaðir. Samböndin sýndu aukin andoxunaráhrif í samræmi við aukna setni þegar notaðir voru ferrulínsýru- og kaffínsýru-sethópar. Í samanburði minnkuðu örveruhemjandi áhrifin á þeim stofnum sem prófað var gegn með aukinni setni samanborið við óbreytt kítósan. Einnig var framkvæmd efnasmíð á N-betaín kítósani með HATU miðluðu kúplunarhvarfi þar sem einfalt efnasmíðaferli var þróað með hárri setni í einu skrefi, án aðkomu verndarhópa. Fullþátta (e. Full factorial) hönnun var notuð til að rannsaka mólhlutföll HATU og þess basa sem notaður var í hvarfinu.

Í verkefninu var þróuð efnasmíð í einu skrefi fyrir TMC með allt að 72% DTM, sértæk efnasmíð á kítósan-hýdroxýsinnamínfjölliðum með allt að 60% DS, sem og hagkvæm aðferð til efnasmíða á N-betaín kítósani með allt að 100% DS. DoE tilraunahönnun reyndist mjög árangursrík þar sem notuð var kerfisbundin leið til hámörkunar á smíði kítósan-afleiða með betrumbætta eiginleika fyrir notkun í lyfja- og læknisfræði.

Abstract

Chitosan, a biopolymer with broad applications, is valued for its antimicrobial, non-toxic, biocompatible, and biodegradable properties, making it particularly useful in healthcare. Chitosan derivatives, which have better solubility and enhanced properties, have been a key area of research. This thesis focuses on developing scalable and efficient processes for synthesizing N-alkyl and N-acyl chitosan derivatives and conjugates, using a Design of Experiments (DoE) approach to optimize the degree of substitution (DS) and improve biological properties for pharmaceutical and other medical applications.

For the synthesis of N,N,N-trimethyl chitosan (TMC), eight experimental designs were conducted, including sequential, fractional, and full factorial designs. Key parameters, such as alkylating agents, bases, molar ratios, solvents, temperature, BA techniques, and reaction times were optimized. A one-step method for TMC synthesis was developed, achieving high degrees of trimethylation (DTM) without O-methylation. To manage viscosity issues, incremental BA and the introduction of a new base, N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) were implemented. A new, low-viscosity method scalable for industrial production was established, yielding high DTM without O-methylation. Polyelectrolyte complex nanoparticles (NPs) were created using TMC and chondroitin sulfate. In vitro biocompatibility and cytotoxicity tests were conducted using human endothelial cells and ovarian cancer cell lines. The effects of DTM, molecular weight, and NP formation were studied.

The synthesis process of chitosan-hydroxycinnamic acid conjugates was investigated by performing analysis by DoE to a series of previously conducted experiments, that were analyzed manually at the time. Key factors were identified, and the biological properties of the conjugates, including antibacterial and antioxidant activities, were explored. The conjugates exhibited increasing antioxidant activity with increasing DS when using ferulic and caffeic acid. In contrast, the antibacterial activity against the tested pathogens decreased with increasing DS compared to unmodified chitosan.

Additionally, the synthesis of N-betaine chitosan was explored using HATU coupling, creating a simple, one-step process with high DS, avoiding the need for multistep synthesis. A full factorial design investigated the molar ratios of HATU and the base used in the reaction.

Overall, the work reported in this thesis developed a one-step synthesis method for TMC with up to 72% DTM, a selective synthesis of chitosan-hydroxycinnamic conjugates with DS up to 60%, and an efficient N-betaine chitosan synthesis method achieving up to 100% substitution. The DoE approach proved highly effective, offering a systematic way to optimize chitosan derivative synthesis for improved pharmaceutical and medical applications.

Um doktorsefnið

Vivien Nagy fæddist í Ungverjalandi árið 1991 og flutti til Íslands árið 2014. Hún lauk BS-gráðu í lífefnaverkfræði við Háskólann í Debrecen í Ungverjalandi og meistaragráðu í lyfjavísindum við Háskóla Íslands árið 2018. Hún hóf doktorsnám sitt árið 2019 undir handleiðslu prófessors Más Mássonar.