Doktorsvörn í læknavísindum - Salvör Rafnsdóttir

Föstudaginn 5. apríl 2024 ver Salvör Rafnsdóttir doktorsritgerð sína í læknavísindum við Læknadeild Háskóla Íslands. Ritgerðin ber heitið: Áhrif utangenaerfða á kælisvar spendýrafrumna. Epigenetic insights into the mammalian mild hypothermia response.

Andmælendur eru dr. Anne Willis, prófessor við University of Cambridge, og dr. Zophonías Oddur Jónsson, prófessor við Líf-og umhverfisvísindadeild HÍ.

Umsjónarkennari og leiðbeinandi var Hans Tómas Björnsson, prófessor. Auk hans sátu Eiríkur Steingrímsson, prófessor, Erna Magnúsdóttir, dósent, Martin Ingi Sigurðsson og Sesselja Sigurborg Ómarsdóttir, prófessorar í doktorsnefnd.

Dr. Sædís Sævarsdóttir, prófessor og varadeildarforseti Læknadeildar, stjórnar athöfninni sem fer fram í Hátíðarsal Háskóla Íslands og hefst kl. 09:00.

Ágrip

Þekkt er að kæling frumna (32-36°C) eykur tjáningu fáeinna þekktra gena. Margt er á huldu um þá innanfrumu- og millifrumuferla sem kæling virkjar og kallaðir hafa verið kælisvarið. Kæling er notuð í læknisfræðilegum tilgangi til að fá fram taugaverndandi áhrif hjá sjúklingum sem hafa orðið fyrir miklum taugaskaða, svo sem eftir hjartastopp eða vegna súrefnisþurrðar í fæðingu. 

Kælivísar (mild hypothermia indicators (MHI)) voru búnir til en þeir segja til um tjáningu þriggja gena (SP1, CIRBP, RBM3) sem þegar eru þekkt að því að gegna hlutverki í kælisvarinu. Þessir kælivísar voru notaðir til að framkvæma lyfjaskimun með SP1+MCRE-MHI kælivísi í leit að virkjun kælisvarsins meðal 1953 lyfja. Tvö lyf (Poziotinib og Entacapone) fundust sem bæði virðast geta virkjað kælisvarið. Næst voru kælivísarnir, SP1-MHI og Lenti-RBM3-MHI, notaðir með framsýnni CRISPR-Cas9-stökkbreytiskimun til þess að finna gen sem virkja eða bæla kælisvarið. Mörg gen fundust sem virðast geta virkjað eða bælt kælisvarið en staðfest var hlutverk eins slíks gens sem bælir kælisvarið, SMYD5. SMYD5 minnkar við 32°C í mannafrumum og í heila músa og sýnir minnkaða bindingu við erfðamengið við 32°C í mannafrumum. Einnig var RNA raðgreining framkvæmd á taugastofnfrumum úr músum í rækt við 37°C og 32°C, og frumum úr dreka ásamt heilaberki músa sem annars vegar höfðu innra hitastig 37°C og hins vegar innra hitastig við 32°C. Í ljós kom að mörg gen breyta tjáningu sinni við kælingu. Þrjátíu og sjö önnur gen fundust sem SMYD5 virðist bæla við 37°C og haga sér því á svipaðan máta og SP1. Loks var framkvæmd framsýn ENU stökkbreytiskimun á músum, til þess að finna gen sem valda afbrigðilegri hitastigsstjórnun við kæliáreiti og birtum lista yfir líkleg hitastigsstjórnandi gen.

Þetta verkefni hefur aukið skilning á kælisvari spendýrafrumna, en mörg gen breyta tjáningu sinni við kælingu eða hafa áhrif á grunnlíkamshitastig lífvera eftir kælingu. Í þessari doktorsritgerð kemur fram hvernig kæling fyrir tilstuðlan utangenaerfða getur haft áhrif á genatjáningu. Einnig fundust tvö lyf sem mögulega geta haft áhrif á kælisvörun, en það býður upp á frekari möguleika til rannsókna á lyfjameðferðum hjá sjúklingum sem þurfa á kælimeðferð að halda.

Abstract

In humans, the expression of several genes is increased with mild hypothermia (32-36°C), however, the precise nature of this mild hypothermia response (MHR) is unknown. In clinical practice MHR is often utilized as a neuroprotective agent in catastrophic events such as after neonatal hypoxic ischemia and cardiac arrest.

In this thesis there were several methods used to gain deeper understanding of some of the characteristics of the MHR. To study these effects there were created and validated several fluorescent mild hypothermia indicators (MHI) which measure regulatory activity of three genes (SP1, CIRBP, RBM3) which have previously been shown to be part of the MHR. To gain further insight into the MHR the MHIs were utilized for two of three different screening strategies. The SP1+MCRE-MHI was used to look for MHR activation after medication exposure to 1953 FDA-approved compounds. This yielded two agents (Poziotinib and Entacapone) that could activate the MHR. Next, a forward CRISPR-Cas9 mutagenesis screen was combined with two MHIs, SP1-MHI and Lenti-RBM3-MHI, to identify a list of potential activators/repressors of SP1 and RBM3. This led to the identification of numerous activators and repressors, including the repressor SMYD5 which was robustly validated. SMYD5 protein amounts and genomic binding decreases at 32°C in vivo and in vitro. RNA-Sequencing was performed of in vitro mouse Neural Progenitor cells (mNPCs) at 37°C and 32°C as well as RNA-sequencing of in vivo mouse hippocampal and cortical cells that had their core temperature either kept at 37°C or lowered to 32°C. There are many genes that have altered expression under hypothermic conditions. A list of additional 37 temperature responsive genes were identified; these genes seem to be regulated in a similar temperature dependent manner as SP1 and CIRBP by SMYD5. Finally, a dominant ENU mutagenesis screen was performed to look for genes that cause abnormality in core temperature under hypothermic stimulus. The first results are promising, and this thesis provides a list of candidate genes that could cause core temperature abnormality, although the list needs further validation.

This project expands the current knowledge of the mild hypothermia pathway in mammalian cells and mammals. Here in this thesis, we provide a mammalian example of how the epigenetic machinery incorporates the influence of environmental cues into the genome of mammalian cells. Also, our study has revealed novel therapeutic avenues for targeted temperature management/therapeutic hypothermia through pharmacological means.

Um doktorsefnið

Salvör Rafnsdóttir er fædd árið 1993 í Edinborg í Skotlandi. Hún útskrifaðist af náttúrufræðibraut Menntaskólans í Reykjavík árið 2013. Salvör lauk BS-prófi og kandídatsprófi í læknisfræði frá Háskóla Íslands árin 2016 og 2019. Doktorsnám hennar við Háskóla Íslands hófst sumarið 2019. Meðfram náminu kláraði Salvör kandídatsár í læknisfræði. Salvör var vorið 2021 Fulbright Visiting Student Researcher við Johns Hopkins University í Bandaríkjunum. Foreldrar Salvarar eru Rafn Benediktsson og Hildur Kristjánsdóttir. Salvör er gift Kristjáni Godsk Rögnvaldssyni lækni og saman eiga þau einn dreng, Stíg.